Estratégias de estabilização e normalização da urina favorecem a análise imparcial do conteúdo urinário de EV

Scientific Reports volume 12, Artigo número: 17663 (2022) Citar este artigo

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A urina apresenta uma fonte ideal de marcadores diagnósticos não invasivos. Algumas questões intrínsecas e metodológicas ainda colocam barreiras ao seu pleno potencial como substrato para biópsia líquida. Ao contrário do sangue, a concentração de urina varia de acordo com a nutrição, hidratação e fatores ambientais. A urina é enriquecida com VEs do trato geniturinário, enquanto sua conservação, purificação e normalização podem introduzir viés na análise de subconjuntos de VE em comparações inter e intra-individuais. O presente estudo avaliou os métodos que diminuem tais vieses, como armazenamento de urina apropriado e viável, método ideal de purificação de EV em etapa única para recuperação de proteínas e RNAs de pequenos volumes de urina e um método de normalização para análise quantitativa de RNAs de EV na urina. Ultracentrifugação, precipitação química e imunoafinidade foram utilizadas para isolar EVs da urina de doadores saudáveis ​​que foi armazenada congelada ou em temperatura ambiente por até 6 meses. Vários parâmetros bioquímicos e EV da urina, incluindo contagem de partículas e conteúdo de proteína, foram comparados em amostras de urina. Para tanto foram realizadas análises de rastreamento de nanopartículas (NTA) e avaliação de proteínas por ensaios BCA, ELISA e WB. Estas medições foram correlacionadas com abundâncias relativas de mRNAs e miRNAs de EV selecionados avaliados por RT-PCR e classificadas quanto à capacidade de refletir e corrigir variações de conteúdo de EV em amostras longitudinais de urina. Todos os métodos de purificação permitiram a recuperação e análise a jusante de EVs a partir de apenas 1 ml de urina. Nossas descobertas destacam a estabilidade a longo prazo dos RNAs EV após o armazenamento da urina à temperatura ambiente, bem como a excelente correlação do conteúdo EV na urina com algumas características bioquímicas medidas rotineiramente, como proteína total na urina e albumina, mas não a creatinina mais convencionalmente usada para normalização da urina. A avaliação comparativa de mRNA e miRNAs em isolados de EV revelou RNAs específicos, em particular RNY4 e pequeno painel de miRNA, cujos níveis refletiram bem a variação de EV entre amostras e, portanto, úteis como possíveis normalizadores pós-analíticos do conteúdo de RNA de EV. Descrevemos algumas soluções realistas de processamento e normalização de urina para leitura imparcial de estudos de biomarcadores EV e amostragem e diagnósticos clínicos de rotina, fornecendo a entrada para o projeto de estudos de validação maiores empregando EVs de urina como biomarcadores para condições e doenças específicas.

A urina é uma fonte atraente e acessível de marcadores diagnósticos potencialmente valiosos para um conjunto de condições clínicas, mais proeminentemente aquelas que afetam o trato urogenital, como doenças ou lesões renais e cânceres urogenitais. Além disso, os biomarcadores urinários demonstraram potencial também para patologias não urológicas1,2, tais como outros cancros (ou seja, cancro da mama ou do pulmão), distúrbios metabólicos e endócrinos (ou seja, diabetes), condições inflamatórias (ou seja, aterosclerose e osteoartrite) e até mesmo doenças neurodegenerativas ou neuropsiquiátricas. doenças. A utilização de testes de urina para diagnosticar doenças é uma prática antiga (por exemplo, detecção de glicose em indivíduos diabéticos provando-a ou atraindo formigas, ou detecção de albumina como indicador de doença renal através de um “teste de espuma”) e tem permanecido um componente subjacente da medicina investigativa ao longo do século XX e início do século XXI3. Com o advento das técnicas modernas de -ômica, é revelada uma miríade de componentes da urina cujas alterações quantitativas e qualitativas deverão ter valor diagnóstico e preditivo na área clínica.

Paradoxalmente, a urina ainda é pouco estudada como fonte totalmente não invasiva de biomarcadores de biópsia líquida que podem ser utilizados longitudinalmente para diagnóstico e monitoramento. Esse paradoxo se deve às características particulares desse biofluido e aos obstáculos metodológicos que ainda interferem na passagem de candidatos a biomarcadores à prerrogativa quantitativa de validação e implementação de ensaios diagnósticos.